Новости

20.06.2017

Прощай, гипс: тяжелые переломы научились лечить без трансплантатов

Если будет установлено, что этот метод, комбинирующий ультразвук, стволовые клетки и генную терапию, безопасен и эффективен и для человека, то травматологию ждет революция.

Читать полностью

19.06.2017

В Институте цитологии РАН открыли Центр клеточных технологий

Новый центр — это одна из первых лабораторий в стране, которая будет работать в соответствии с требованиями нового закона о биомедицинских клеточных продуктах

Читать полностью

16.06.2017

Человеческий жир поможет в лечении суставов

Ученые предлагают использовать для лечения костных заболеваний аппарат Lipogems, с помощью которого из жировой ткани выделяются стволовые клетки

Читать полностью

15.06.2017

Установлены генетические маркеры старения стволовых клеток

Выявили новый механизм хронологического старения стволовых клеток жировой ткани, принципиально отличающийся от механизма старения дифференцированных клеток.

Читать полностью

15.06.2017

Терапия стволовыми клетками вернула мышам способность к зачатию

Стволовые клетки, взятые из яичников молодых мышей, были имплантированы более старым стерильным особям

Читать полностью

АРХИВ НОВОСТЕЙ

На пути к расшифровке транскрипционной программы гемопоэтических стволовых клеток

Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) давно оправдала возложенные на нее надежды и ожидания, став первым и пока единственным примером истинно успешного использования стволовых клеток в терапии. Но, несмотря на достигнутый прогресс, до сих пор не предложено эффективного способа экспансии ГСК в культуре, и поэтому количество ГСК в распоряжении исследователей и клиницистов зависит от особенностей самого донора и успеха процедуры выделения клеточного материала. Более того, хотя поверхностный фенотип ГСК хорошо описан [1], мало что известно о генетическом контроле транскрипционного профиля этих клеток. К примеру, было обнаружено, что нуклеарный фактор Hoxb4 и его производные (Hoxa9, NA10HD), по-видимому, могут способствовать экспансии ГСК [2, 3]. В отличии от ГСК, транскрипционная сеть взаимодействий в эмбриональных стволовых клетках (ЭСК) уже хорошо изучена. Очевидно, что венцом таких исследований стали работы по перепрограммированию дифференцированных клеток и получению плюрипотентных iPS-клеток [4].

Значительного прогресса в выяснении транскрипционной программы, отвечающей за функциональную активность ГСК, удалось достигнуть группе канадских исследователей под руководством Guy Sauvageau, результаты работы которых были опубликованы в журнале «Cell».

По аналогии с ЭСК, плюрипотентный статус которых контролируется несколькими ключевыми транскрипционными факторами (Oct4, Sox2, Nanog, Klf4 и др.), E. Deneault с соавт. предположили, что основные свойства ГСК (способность к самообновлению и дифференцировке) также могут зависеть от активности подобных «мастер-регуляторов». Для обнаружения этих регуляторных белков авторы сначала подготовили базу данных, куда вошли 689 нуклеарных факторов, так или иначе претендующих на роль в контроле функционального состояния ГСК (первичные данные были получены из исследований глобального профиля генной экспрессии в ГСК и лейкозных стволовых клетках). Основываясь на специфичности, выраженности и стабильности экспрессии этих генов в ГСК, были отобраны 104 гена-кандидата для дальнейшего функционального скрининга (важно, что среди выбранных генов оказались известные регуляторы кроветворения: Egr1, Gata2, Sfpi1 (PU.1), Foxo1, Meis1, Myb, Hoxa9 и Runx1).

Функциональный скрининг заключался в следующем (рис.). Отсортированные ГСК (1500 клеток; фенотип CD150+ CD48– Lin–) из костного мозга CD45.1+ мышей культивировали в 96-луночном планшете совместно с клетками-продуцентами ретровирусного вектора, несущего ген одного из 104 отобранных регуляторных факторов. После инфицирования ГСК в течение пяти суток часть клеток трансплантировали конгенным CD45.2+ мышам совместно с 2 × 105 CD45.2+ костномозговыми клетками (конкурентная трансплантация). Оставшиеся ГСК культивировали еще 7 дней, после чего проводили аналогичную трансплантацию. Затем через 4-недельные интервалы оценивался вклад донорских (т. е. CD45.1+) ГСК в долгосрочное восстановление гемопоэза у мышей-реципиентов (так наз. тест конкурентных репопуляционных единиц  CRU assay). В качестве негативного контроля трансплантирвались ГСК, инфецированные «пустым» ретровирусным вектором.

Из 689-ти факторов, вошедших в первичную базу данных, после оценки их релевантности были отобраны 104 гена для функционального скрининга. В результате скрининга исследователи выделили группу генов с Hoxb4-подобным уровнем активности, из которых десять подтвердили свою значимость после повторного анализа (выделены красным; оставшиеся восемь генов выделены оранжевым). Б — Функциональный скрининг. Пояснения в тексте.

Авторы использвали Hoxb4 в качестве гена-прототипа (позитивного контроля), для которого уже была известна способность усиливать функцию ГСК [5]. Так, значительное увеличение репопуляционной активности было отмечено у Hoxb4-инфецированных ГСК после дополнительного культивирования в течение 7 суток, что позволило на основе стандартного отклонения среднего установить нижнюю границу (cut-off) для разделения других генов-кандидатов по функциональной активности на «Hoxb4-подобные» гены (18 генов) и гены «с меньшим потенциалом» (оставшиеся 86). После проведения нескольких независимых экспериментов из 18-ти «Hoxb4-подобных» генов только десять подтвердили свою высокую (т. е. сравнимую с Hoxb4) функциональную активность: Smarcc1, Vps72, Fos, Trim27, Sox4, Klf10, Ski, Prdm16, Erdr1 и Sfpi1. Отметим, что оставшиеся восемь генов (Cnbp, Hdac1, Hmgb1, Hnrpdl, Pml, Tcfec, Xbp1, Zfp472), хотя и не вошли в конечную «десятку», тоже обладали высоким функкциональным потенциалом (в сравнении с негативным контролем). E. Deneault с соавт. подтвердили, что все десять обнаруженных генов активно и специфически экспрессируются в интактных ГСК, выделенных из костного мозга и фетальной печени. Тем не менее, экспрессия этих генов в инфецированных ГСК намного превосходила естественный эндогенный уровень (от 3- до 1000-кратного).

Известно, что при культивировании выделенных ГСК значительная доля клеток теряет статус «стволовых» и начинает дифференцироваться в клетки крови (преимущественно миелоидного ряда). Авторы показали, что у ГСК, экспрессирующих Hoxb4-подобные гены, напротив, дифференцировка in vitro блокируется. В то же время, значимые изменения в пролиферативной активности и уровне клеточной гибели ГСК в культуре не были обнаружены. Ситуация изменяется после трансплантации инфецированных ГСК мышам-реципиентам. Введеннные клетки успешно восстанавливали кроветворение у животных, о чем свидетельствовали морфологический и цитологический анализ костного мозга и селезенки, иммунофенотипирование донорских (CD45.1+) клеток и клональные тесты для тимических и костномозговых клеток. При этом экспрессия трансгенов в донорских клетках сохранялась длительное время после трансплантации (по крайней мере, до 20-й недели). Исключением стал ген Prdm16: ГСК, несущие Prdm16, не были способны к полноценной репопуляции кроветворных органов.

E. Deneault с соавт. получили свидетельства того, что по крайней мере некоторые ГСК, экспрессирующие Hoxb4-подобные гены, способны к самообновлению in vitro. Так, у разных мышей, которым трансплантировали ГСК из одной и той культуры, в кроветворных тканях были обнаружены идентичные клеточные клоны (т. е. клоны с одинаковыми сайтами провирусной интеграции). Это указывает на то, что инфицированные ГСК претерпевали симметричные деления в культуре, прежде чем были трансплантированы разным животным. Тем не менее, как отмечают сами авторы, подобного теста явно недостаточно, чтобы говорить о способности стволовых клеток к самообновлению, и для подтверждения этого потребуется расширенный клональный анализ.

Наиболее неожиданным оказался тот факт, что в кроветворных тканях большинства мышей, которым трансплантировали ГСК, трансдуцированные генами Fos, Sfpi1, Tcfec и Hmgb1, трансгены обнаружить не удалось. Это означает, что экспрессия этих генов в самих ГСК не обязательна для усиления их функциональной активности, и, внешние факторы, продуцируемые фидерными клетками, по всей видимости, ответственны за подобный эффект. Вероятно также, что чрезмерно высокая экспрессия этих генов может вызывать гибель трансдуцированных ГСК, способствуя экспансии оставшихся клеток. Чтобы проверить свои предположения, G. Sauvageau и коллеги трансдуцировали NIH 3T3 клетки, не способные к вирусной продукции, ретровирусным вектором, несущим один из четырех указанных генов. Использование этих клеток в качестве фидерных гарантировало, что репопуляционный потенциал ГСК не будет зависеть от экспрессии гена в самих ГСК, а будет контролироваться лишь внешними сигналами от фидерных клеток. Выяснилось, что оверэкспрессия трех (Fos, Tcfec и Hmgb1) из четырех тестированных генов в фидерных клетках достаточна для стимуляции репопуляционного потенциала ГСК и восстановления гемопоэза у мышей, как при использовании трансдуцированных стволовых клеток.

Работа исследовательской группы G. Sauvageau имеет первостепенную значимость как для практической медицины, так и для фундаментальной биологии. С точки зрения клинической науки, полученные результаты свидетельствуют о возможности стимуляции функциональной активности ГСК in vitro без генетической модификации клеток. В дальнейшем предстоит выяснить природу экзогенных факторов, продуцируемых трансфецированными фидерными клетками, и определить функциональную значимость этих факторов для ГСК человека. Тем не менее, экспансия ГСК in vitro — не единственная стратегия, направленная на увеличение количества стволовых клеток в трансплантате. Новые фармакологические агенты, усиливающие мобилизацию ГСК (выход клеток из костного мозга в периферический кровоток), могут стать весомой альтернативой in vitro манипуляциям. Например, на роль мощного мобилизирующего средства претендует агонист TLR2 — модифицированный липопептид из Mycoplasma, активность которого у мышей превосходит таковую для широко используемого G-CSF [6].

Функциональный скрининг более чем ста генов, функция большинства из которых оставалась не ясной, и создание общедоступной базы данных [7] стали важнейшим шагом на пути к расшифровке транскрипционной программы ГСК. Работа G. Sauvageau и коллег свидетельствует, что регуляция транскрипции в данных стволовых клетках отнюдь не проста. Вполне вероятно, что многие транскрипционные факторы, модификаторы хроматина, микроРНК и другие регуляторы вместе формируют комплексную сеть взаимодействий, зависимую от количественных и локализационных изменений отдельных компонентов. С одной стороны, такая многокомпонентная программа транскрипционной регуляции в ГСК согласуется с позицией, что фоновая экспрессия одновременно многих генов-регуляторов определяет пластичность стволовых клеток, их потентность к дифференцировке в различных направлениях [8]. С другой стороны, концепция «мастер»-гена (master gene) [9], т. е. ключевого регуляторного (как правило, транскрипционного) фактора, отвечающего за дифференцировку клетки в конкретный клеточный тип, за 20 лет своего существования нашла широкую поддержку среди биологов и легла в основу технологии индуцированного перепрограммирования зрелых клеток [10, 11]. Однако на сегодняшний день правило «один (или несколько) мастер-генов — один клеточный тип» требует преобразования. Недавние исследования продемонстрировали, что многие дифференцированные клетки, в частности, Т-лимфоциты, намного пластичнее, нежели думали ранее. Например, популяции CD4+ Т-клеток, развитие которых, казалось, идеально соответствовало концепции мастер-гена (дифференцировочная программа Th1-, Th2-, Th17- и регуляторные T-клеток контролируется, соответственно, транскрипционными факторами T-bet, GATA3, RORγt и FoxP3), как оказалось, экспрессируют либо способны экспрессировать ключевые гены «чужой» линии дифференцировки [12, 13].

Объяснения вышеупомянутых результатов, в том числе E. Deneault с соавт., по-видимому, следует искать в работах системных биологов, которые рассматривают «популяции» и «типы» клеток как динамические состояния (аттракторы) с различной степенью устойчивости [14]. Каждая клетка под влиянием внешних сигналов непрерывно изменяет свой транскрипционный профиль, «передвигаясь» по фазовому пространству внутри и между зонами притяжения. В этом случае за удерживание клетки внутри определенного аттрактора (а значит, принадлежность клетки какой-то «популяции») зависит от уровня экспрессии и активности сразу многих взаимодействующих транскрипционных регуляторов. Хочется верить, что расшифровка этих сложных регуляторных сетей и количественная оценка транскрипционных изменений на системном уровне откроет путь в самое «сердце» динамичной физиологии клетки и к новым подходам в терапии.

 

Литература

1. Weissman I.L., Shizuru J.A. The origins of the identification and isolation of hematopoietic stem cells, and their capability to induce donor-specific transplantation tolerance and treat autoimmune diseases. Blood 2008; 112(9): 3543–3553. [Full Text]

2. Ohta H., Sekulovic S., Bakovic S. et al. Near-maximal expansions of hematopoietic stem cells in culture using NUP98-HOX fusions. Exp. Hematol. 2007; 35(5): 817–830. [Abstract]

3. Thorsteinsdottir U., Mamo A., Kroon E. et al. Overexpression of the myeloid leukemia-associated Hoxa9 gene in bone marrow cells induces stem cell expansion. Blood 2002; 99(1): 121–129. [Abstract]

4. Jaenisch R., Young R. Stem cells, the molecular circuitry of pluripotency and nuclear reprogramming. Cell 2008; 132(4): 567–582. [Abstract]

5. Antonchuk J., Sauvageau G., Humphries R.K. HOXB4-induced expansion of adult hematopoietic stem cells ex vivo. Cell 2002; 109(1): 39–45. [Abstract]

6. А. В. Гудков,  http://www.dsls.usra.edu/meetings/radiation2007/

7. The Hematopoietic Stem Cell Self-Renewal Resource, Institute for Research in Immunology and Cancer: http://www.bioinfo.iric.ca/self-renewal/

8. Zipori D. The nature of stem cells: state rather than entity. Nat. Rev. Genet. 2004; 5(11): 873–878. [Abstract]

9. Weintraub H., Tapscott S.J., Davis R.L. et al. Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD. PNAS 1989; 86(14): 5434–5438. [Abstract]

10. Takeuchi J.K., Bruneau B.G. Directed transdifferentiation of mouse mesoderm to heart tissue by defined factors. Nature 2009; 459(7247): 708–711. [Abstract]

11. Zhou Q., Brown J., Kanarek A., Rajagopal J., Melton D.A. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells. Nature 2008; 455(7213): 627–632. [Abstract]

12. Lee Y.K., Mukasa R., Hatton R.D., Weaver C.T. Developmental plasticity of Th17 and Treg cells. Curr. Opin. Immunol. 2009; 21(3): 274–280. [Abstract]

13. Wei G., Wei L., Zhu J., Zang C., Hu-Li J. et al. Global mapping of H3K4me3 and H3K27me3 reveals specificity and plasticity in lineage fate determination of differentiating CD4+ T cells. Immunity 2009; 30(1): 155–167. [Abstract]

14. Enver T., Pera M., Peterson C., Andrews P.W. Stem cell states, fates, and the rules of attraction. Cell Stem Cell 2009; 4(5): 387–397. [Abstract]

 

Источник: «Клеточная трансплантология и тканевая инженерия» по материалам: Deneault E., Cellot S., Faubert A. et al. A functional screen to identify novel effectors of hematopoietic stem cell activity. Cell 2009; 137(2): 369–79.